Microscopie électronique, quel calendrier prévoir ?

Microscopie électronique, quel calendrier prévoir ? La cryo microscopie électronique de particules isolées (cryo-EM) est devenue une technique incontournable pour l’obtention de structure 3D des protéines et de complexes macromoléculaires à des résolutions atomiques. Ceci fut rendu possible grâce au développement important de l’instrumentation et des techniques d’analyses depuis la dernière décennie (voir lien ici). De plus en plus de laboratoires s’intéressent à cette technique, alors de l’échantillon à l’obtention d’une structure cryo-EM quel calendrier prévoir ?

• Préparation de l’échantillon biologique. S’assurer de sa bonne qualité : état de pureté, homogénéité, stabilité et activité si applicable. Durée variable selon l’échantillon.
• Microscopie en coloration négative. Il est fortement recommandé de vérifier la qualité de l’échantillon par coloration négative (particules isolées visibles, stabilité de l’échantillon, taille et aspect des particules). Cela permet une première analyse rapide et facilitée par le contraste plus important qu’en conditions cryo. Préparation de grilles et visualisation sur un microscope de type FEI Twin 120 kV à ½-1 journée.
• Screening des conditions cryo. La vitrification de l’échantillon biologique sur grilles cryo est une étape empirique et échantillon-dépendant qui implique de tester plusieurs types de grilles et plusieurs conditions de vitrification (congélation 1/2 journée). Les grilles cryo sont alors visualisées sur un microscope de type FEI Glacios 200 kV pour (i) sélectionner les meilleures conditions de vitrification, (ii) vérifier la stabilité, l’homogénéité de l’échantillon et la distribution des particules, (iii) ajuster la concentration de l’échantillon au besoin (1 journée). Cette étape nécessite souvent d’être répétée pour optimiser les conditions de vitrification.
• Collecte de données, elle se fait sur un microscope type FEI Glacios 200 kV ou FEI Titan Krios 300 kV pour atteindre les plus hautes résolutions (les grilles doivent impérativement avoir été optimisées pour prétendre à une collecte sur Titan Krios). Le temps de la collecte dépend de la vitesse d’enregistrement de la caméra et du créneau disponible (1-4 jours).
• Analyse des images. Les images collectées sont ensuite transférées, traitées et analysées. Cette étape dépend de nombreux facteurs (qualité des images, temps de calculs, distribution et orientation des particules, résolution souhaitée, etc.) et peut prendre de quelques jours à plusieurs semaines.

A noter, l’accès microscopes est souvent un facteur limitant et dois être pris en compte dans l’établissement du calendrier.

Pour plus d'informations: Specimen preparation for high resolution cryo-EM. Methods Enzymol. 2016 (PMID: 27572723)

Janvier 2022.